[目的]高效利用暗褐脉柄牛肝菌资源，开发其多糖功能性食品。[方法]取暗褐脉柄牛肝菌菌丝发酵培养，低温减压浓缩，乙醇沉淀，DEAE-52纤维素柱色谱分离纯化，透析袋透析除去小分子杂质制备多糖。总糖含量采用苯酚—硫酸显色法测定，液质联用法测定单糖组成，紫外分光光度法判断是否存在核酸和蛋白等杂质；通过红外光谱和核磁共振波谱，对多糖的结构进行分析。[结果]制备的多糖总糖含量为84%，主要单糖种类有：葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物质的量比为2.07∶1.95∶1.00∶1.58。红外光谱和核磁共振波谱分析具有多糖吸收峰，含α型吡喃糖。[结论]从暗褐脉柄牛肝菌发酵液中制备的多糖主要由4种单糖组成，结构中含α型吡喃糖。